一、細(xì)胞毒性試驗(yàn)

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一種在離體狀態(tài)下模擬生物體生長(zhǎng)環(huán)境，檢測(cè)受試物接觸機(jī)體組織后所發(fā)生的細(xì)胞溶解、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和其他毒性作用的體外試驗(yàn)。

二、氣態(tài)或揮發(fā)性受試物細(xì)胞毒性試驗(yàn)難點(diǎn)

1. 氣態(tài)或揮發(fā)性物質(zhì)應(yīng)在適當(dāng)?shù)娜径救萜鲀?nèi)進(jìn)行，但其試驗(yàn)步驟無(wú)法按照正常液體或固體試驗(yàn)樣品的細(xì)胞毒性試驗(yàn)步驟進(jìn)行；

2.對(duì)于氣態(tài)或揮發(fā)性受試物，其在染毒過(guò)程中的氣體配比以及無(wú)菌環(huán)境都需要保證其不會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

三、氣態(tài)或揮發(fā)性受試物細(xì)胞毒性試驗(yàn)步驟

匯智泰康對(duì)于氣態(tài)或揮發(fā)性受試物體外試驗(yàn)有豐富的經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)以MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性作為舉例。

1.試驗(yàn)系統(tǒng)

應(yīng)選擇來(lái)源明確的原代細(xì)胞或細(xì)胞系，可根據(jù)要求鑒定有無(wú)支原體污染。

2.試驗(yàn)樣品制備

若試驗(yàn)樣品室溫下為氣體，可選擇體積大小為2 L~40 L的采樣袋（根據(jù)染毒時(shí)長(zhǎng)調(diào)整），作為細(xì)胞毒性試驗(yàn)的密閉性染毒裝置，經(jīng)高壓滅菌后，抽真空處理后，將配制好的試驗(yàn)樣品導(dǎo)入采樣袋中，試驗(yàn)樣品在密閉、無(wú)菌條件下以氣態(tài)方式，按接觸細(xì)胞時(shí)間和濃度進(jìn)行染毒劑量設(shè)計(jì)。

3.細(xì)胞準(zhǔn)備

選擇48 h～72 h生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞當(dāng)天用于試驗(yàn)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁵/mL。細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和試驗(yàn)樣品共4組，每組一塊培養(yǎng)板（空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照可共用一塊培養(yǎng)板），每板各設(shè)6～8孔，每孔接種100 µl細(xì)胞懸液。置CO₂培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，使其細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

4.試驗(yàn)分組

試驗(yàn)包括空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和試驗(yàn)樣品組。

• • 空白對(duì)照組不放入采樣袋，不加試驗(yàn)樣品的完全培養(yǎng)液；
  • 陽(yáng)性對(duì)照組不放入采樣袋，加入10% DMSO的完全培養(yǎng)液；
  • 陰性對(duì)照組放入無(wú)菌采樣袋，加入無(wú)試驗(yàn)樣品的無(wú)菌空氣（無(wú)菌空氣+5%二氧化碳）；
  • 試驗(yàn)樣品組放入無(wú)菌采樣袋，加入一定體積的試驗(yàn)樣品+氧氣+無(wú)菌空氣+5%二氧化碳（根據(jù)空氣中含氧量占21%計(jì)算）。

5.染毒處理

吸除每孔中的上層液體?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和試驗(yàn)樣品組重新加入完全培養(yǎng)液，100 μL/孔；陽(yáng)性對(duì)照組加入含10%二甲基亞砜的完全培養(yǎng)液；每孔100 µl，置CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)靜置培養(yǎng)48 h同時(shí)，各組區(qū)別如下：

• • 空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組不放采樣袋中；
  • 陰性對(duì)照組置無(wú)菌采樣袋中，無(wú)試驗(yàn)樣品氣體，其他與試驗(yàn)樣品組一致；
  • 試驗(yàn)樣品組置無(wú)菌采樣袋中，含最高濃度的試驗(yàn)樣品氣體和其他混合氣體；
  • 陰性對(duì)照組和試驗(yàn)樣品組的細(xì)胞培養(yǎng)板放置在無(wú)菌采樣袋中，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)板頂蓋，密閉無(wú)菌采樣袋抽真空后，導(dǎo)入混合氣體，37 ℃保持接觸4h，然后打開(kāi)無(wú)菌采樣袋，蓋上頂蓋，繼續(xù)在無(wú)菌采樣袋中置CO₂培養(yǎng)箱37 ℃共靜置培養(yǎng)4+44h。

6.細(xì)胞觀察

取出細(xì)胞培養(yǎng)板，置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)板中每個(gè)孔的細(xì)胞形態(tài)，判定細(xì)胞接種系統(tǒng)誤差和各組細(xì)胞的增長(zhǎng)特性。

細(xì)胞培養(yǎng)板對(duì)細(xì)胞形態(tài)檢查后小心移除培養(yǎng)液。將50 μL MTT溶液加到每一實(shí)驗(yàn)孔中，平板在37℃培養(yǎng)箱中再孵育2 h。然后棄去MTT溶液，每孔加入100 μL異丙醇溶液。震蕩細(xì)胞培養(yǎng)板10 min，在酶標(biāo)儀570 nm和630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）。

四、結(jié)果評(píng)價(jià)和解釋

1.試驗(yàn)系統(tǒng)有效性的判定標(biāo)準(zhǔn)

空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好；陰性對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，OD平均值≥0.2且陽(yáng)性對(duì)照組的存活率<30%，判定試驗(yàn)系統(tǒng)有效。

2.試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

受試物組如存活率下降到陰性對(duì)照的70%以下，則均有潛在的細(xì)胞毒性，判定為陽(yáng)性；否則判定為陰性。